Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong những năm gần đây, nhờ áp dụng công nghệ mới, người ta đã rút ngắn thời gian cần thiết để đưa một giống mới có khả năng cho năng suất cao, ổn định phẩm chất vào trồng qui mô lớn. Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại.

Lợi điểm của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật:

  • Tạo ra các cây con đồng nhất và giống với cây mẹ, tránh trường hợp bị thoái hóa giống đối với cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo.
  • So với kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết, giâm, ghép cành), nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một các thể ban đầu trong một thời gian ngắn.
  • Có thế tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh.
  • Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh.
  • Việc trao đổi giống được dễ dàng.

Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật

Yêu cầu cơ bản nhất của một phòng nuôi cấy mô là phải bảo đảm vô trùng. Khái niệm vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy, vô trùng phòng nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cây được hoàn toàn vồ trùng. Điều đó đòi hỏi hai thiết bị cần thiết:

  • Thiết bị tiệt trùng hay nồi tiệt trùng (autoclave); thiết bị này được dùng để thanh trùng môi trường và cả dụng cụ thí nghiệm. Thiết bị tiệt trùng có thể theo nguyên tắc nhiệt từ hơi nước hoặc nhiệt từ không khí khô.
  • Buồng nuối cấy hay phòng nuôi cấy: phải được tiệt trùng bằng tia tử ngoại và được vệ sinh liên tục sau mỗi lần thao tác. Có thể làm vệ sinh bằng dung dịch formol 40%.

Các yêu cầu cở bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:

  • Khi thiết lập phòng nuôi cây mô thực vật phải bảo đảm được tính liên tục thuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô.
  • Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối cùng.
  • Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật và từng giai đoạn nuôi cấy.
  • Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi nuôi cấy.

Quy trình nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô

Hiện nay, người ta xây dựng quy trinh nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô khác nhau tùy từng loại cây. Ta có thể viết qui trình chung như sau:

Thực hành nuôi cấy mô

Thiết bị dụng cụ

Các thiết bị của phòng thí nghiệm vô trùng:

+ Nồi hấp vô trùng.

+ Tủ cấy vô trùng.

Các thiết bị căn bản:

+ Tủ lạnh,

+ Tủ sấy.

+ Cân phân tích.

+ Máy đo pH.

+ Máy cất nước.

+ Bếp đun môi trường.

+ Kính lúp 2 mắt.

Các thiết bị trang bị cho phòng sáng nuôi cây:

+ Kệ để bình mô có gắn đèn.

+ Máy điều hòa nhiệt độ

Dụng cụ thủy tinh và vật dụng nhỏ:

+ Ống nghiệm 150 x 24mm.

+ Bình tam giác 300ml.

+ Gòn không thấm.

+ Pippette các loại.

+ Becher 250ml, 500ml, 1000ml.

+ Ống đồng 1000ml.

+ Bếp đun mõi trường.

十 Nồi nấu môi trường bằng inox.

+ Piĩice, dao mổ và các dụng cụ khác.


  • Nguyên liệUy hóa chất

一 Các hóa chất khử trùng mẫu vật:

4- Benzalkonium chloride (0,01 – 0,1%)

+ Calcium hypochỉoride (9 – 10%).

+ Hydrogen peroxide (3 – 12%),

+ Silver nitrate (1%)*

+ Sodium hypochloride (0,5 – 5%).

+ Alcool tuyệt đối-

—Các hóa chất pha mỏi trường nuôi cấy:

Ví dụ: môi trường Murashige – Skoog (MS) gồm các thành phần sau:

  • Skoog 1:
NH4N03 1650 mg/1
KNOS 1900 mg/1
CaCl2.2H20 440 mg/1
KH2PO4 170 mg/1
MgS04.7H20 370 mg/1
  • Skoog 2:

Na2EDTA

FeSCXi

  • Skoog 3:

MnS04. 4H20 H3PO4

ZnS04. 4H20 KI

CuS045H20 C0CỈ2. 6H2O

37,3              mgA

27,8              mg/1

22,3              mg/1

6,2                mg/l

8,6           mg/1

  • 83 mg/1
  • 25 mg/1
  • 025           mg/1

► Acid amin và Vitamin:

2,0 – 100 – 1, 0 – 30,0 – 63

mg/1 – mg/1 – mg/I – mg/1 – mg/I

Glycin Inositol Thiamin HC1

  • Đường:

+ Các chất điều hòa tăng trưởng; IAA, IBA, NAA,  cytokine, gibbereliin.

4. Phương phảp tiến hành

  1. Điều chế môi trường nuôi cấy: Để việc pha chê môi trường được dễ dàng, người ta thường sử dụng các dung

dịch đậm đặc hóa chất đế dưa vào trong thành phần cúa môi trường, gọi là “dung dịch mẹ”. Có thể điều chế dung dịch mẹ chỉ có 1 hóa chất hoặc gồm nhiều hóa chất. Người ta thường dùng 5 dung dịch mẹ:

-1 dung dịch mẹ bao gồm tất cả các muối khoáng đa lượng (macro—elements) ngoại trừ muối Calcium (để tránh sự trầm hiện); có thể làm đậm dặc chúng 100 lần,

-1 dung dịch mẹ gồm muôi Calcium (X 100).

—1 dung dịch mẹ gồm các muôi vi lượng (micro elements (xlOO),

-1 dung dịch mẹ gồm các vitamin nhóm B (X 1000),


-1 dung dịch mẹ gồm Fe 一 EDTA (X 100).

-1 dung dịch mẹ gồm các vitamin nhóm B {X 1000), ngoại trừ Myo-inositol sẽ dược hòa tan trong lúc điều chế môi trường.

-Đối với chất điều hòa tãng trưởng, người ta pha chế 1 dung dịch mẹ có nồng độ là 0,1 g/I hoặc 0,1 mg/1.

Môi trường được pha chế theo các bước sau:

  • Pha loãng ĩũiẰốì khoáng (macro và micro elements), kẽ đến điều chỉnh thể tích bằng ống đong.
  • Đo pH, điều chỉnh pH với KOH và HC1 N/10t thông thường pH từ 5,5 đến 5,8 tùy yẽu cầu.
  • Thêm đường, agar vào, lắc đều.
  • Đun nóng môi trường cho đến lúc sôi hoàn toàn trong lúc lắc liên tục môi trường.
  • Khi agar tan hoàn toàn, thêm các vitamin, các chất điều hòa tăng trưởng và các chất khác.
  • Lắc đều môi trường.
  • Phân phối môi trường vào các bình chứa bằng thủy tinh dùng cho sự nuôi cấy.
  • Khử trùng môi trường cấy: môi trường cấy được khử trùng bằng autoclave ở 120°c trong 20 phút-
  • Chọn lựa và khử trùng mô thực vật

Tất cả các bộ phận của thực vật đều có khả năng nuôi cấy, nhưng để thành công, ta sử dụng đôt của cây.

Thực hành: Chọn những đoạn thân non, khỏe mạnh của cây sung Mỹ, cắt thành từng do’t.

Khứ trùng mô cấy: Tùy từng loại cây mà ta chọn loại hóa chất và thời gian khử trùng khác nhau. Cách khử trùng tiêu biếu:

—Rửa kỹ mẫu bằng nước sạch.

-Rửa mẫu bằng xà phòng 3 lần.

—Rửa sạch xà phòng bằng nước cất,

-Ngâm alcool 70° trong 丄 phút.

一 Rửa sạch alcool bằng nước cât vô trùng.

-Ngâm mẫu vào dung dịch hypochloride calcium 6% trong 25 phút.

-Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho sạch hypochloride calcium.

  • Chuẩn bị cấy; Để chuẩn bị cấy, tiến hành các thao tác sau đây:

-Dùng bông gòn tẩm alcool 70°, lau kỹ tất cả các thành đứng và ngang ở bên trong tủ cấy, lau bàn làm việc của tủ cây.

-Phun alcool 7Ữ° tất cả các góc kẽ tủ cấy.

—Mở đèn cực tím (UV), 5 phút sau mở quạt gió, tắt đèn cực tím,

-Đốt tất cả các dụng cụ sau khi nhúng chúng vào alcool 90°.

-Các dụng cụ được ngâm vào một cái ly có chân chứa alcool 90°.

-Đưa vào tủ cấy: đèn cồnfgiấy khử trùng để trong 1 túi (giấy nhôm hoặc bao bì), các hộp petri đã khử trùng, các bình nuôi cây có chứa môi trường cấy.

  • Các thao tác khi làm việc trong tủ cấy vô trùng:

一 Trước khi làm việc cần rửa tay bằng xà bông tiệt trùng, kế đến ỉau tay bằng alcool 70° rồi rửa lại bằng nước vô trùng.

-Thay đổi thường xuyên các dụng cụ trong tủ cấy, các dụng cụ này được khử trùng thường xuyên (nhung vào alcool 90° rồi đốt), việc thay đổi dụng cụ thường được thực hiện sau khi làm việc trên 2 đến 5 mô thực vật,

一 Một khi mô đã sẵn sàng,chủng ta lấy chúng đi nhờ

  1. cái pince năm giữa ngón cái, ngón trỏ và ngón giữa, Đồng thời ngón út và ngón áp út của cùng bàn tay giữ lấy nút ống nghiệm (hoặc bình tam giác) để không đặt nút xuống mặt bànT nếu không sẽ dễ nhiễm trùng nút ảnh hướng đến bình nuôi cây.
  • Đặt mô thực vật trên môi trường cấy trong một thời gian ngắn Dhâ^t, sự nhanh nhẹn là một trong những điều kiện thành công cưa các sự nuôi cấy.

一 Hở qua ngọn lửa một cách có hệ thống cổ các bình nuôi cấy, đậy nút lại,

  • Nuôi cây sau khi cấy:

Bình thường, các bình nuôi cây được đặt trong “phòng sáng” trên các kệ;

-Cường độ ánh sáng: 12w/m2 (khoảng 2.500 lux).

-Nhiệt độ được điểu chỉnh từ 20 đến 25°c.

-Thời gian chiếu sáng 16 giờ trong ngày.

Một khi các bình nuôi cây được đặt trong phòng sáng, ta cần kiểm tra sự nhiễm trùng của chúng, 1 tuần sau khi cấy.

Ý kiến của bạn